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【詳解】HE染色實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題及其處理方法

來(lái)源：時(shí)間：2024-12-06 10:23:25 瀏覽：14122次

【詳解】HE染色實(shí)驗(yàn)中的常見(jiàn)問(wèn)題及其處理方法

HE染色（蘇木精-伊紅染色）是組織學(xué)、胚胎學(xué)和病理學(xué)中最常用的技術(shù)之一，用于觀察細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的結(jié)構(gòu)；然而，在實(shí)際操作中，常常會(huì)遇到各種問(wèn)題，影響染色結(jié)果的質(zhì)量。

一、基本原理

HE染色法利用蘇木精（堿性染料）和伊紅（酸性染料）分別對(duì)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行染色。蘇木精主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色，而伊紅則使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。通過(guò)這種染色方法，可以清晰地觀察到細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和組織的形態(tài)。

二、常見(jiàn)問(wèn)題及處理方法

（1）著色過(guò)深或過(guò)淺

1. 原因：染色時(shí)間控制不佳，HE染色需要通過(guò)鏡檢來(lái)控制時(shí)間，染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響染色效果；分化時(shí)間不當(dāng)，過(guò)度分化會(huì)導(dǎo)致染色太淺，而分化不足則會(huì)使染色過(guò)深。

2. 處理方法：通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳染色時(shí)間，一般情況下新鮮蘇木素染色時(shí)間在1-3分鐘，分化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)；如果染色過(guò)深，可以適當(dāng)縮短蘇木素染色時(shí)間，或增加分化時(shí)間；如果染色過(guò)淺，可以適當(dāng)延長(zhǎng)蘇木素染色時(shí)間，或減少分化時(shí)間；過(guò)度分化后，可以用水洗后重新復(fù)染蘇木素。

（2）染色不均

1. 原因：切片厚度不一，切片有褶皺或裂痕，導(dǎo)致過(guò)厚或過(guò)薄的部分在染色時(shí)吸收染液的程度不同；染色時(shí)間不足或過(guò)長(zhǎng)；脫蠟水化不充分；試劑分布不均勻。

2. 處理方法：提高切片技術(shù)，確保切片厚度均勻，厚度一般在3-5微米，切片過(guò)程中避免產(chǎn)生刀痕和褶皺；嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間進(jìn)行染色；脫蠟前確保玻片干透，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間把控二甲苯停留時(shí)間（二甲苯110分鐘、二甲苯110分鐘）；在染色過(guò)程中適當(dāng)晃動(dòng)切片，確保試劑均勻分布。

（3）染色后切片不清晰，霧化，斑點(diǎn)

1. 原因：烤片溫度過(guò)低，時(shí)間不夠，導(dǎo)致脫蠟不徹底，切片留存白色斑點(diǎn)；染色后切片脫水時(shí)間不合理，切片上殘留水分，使切片霧化；蓋玻片上殘留封固劑，導(dǎo)致切片不清晰；組織標(biāo)本已發(fā)生自溶或取材后沒(méi)及時(shí)固定或固定液濃度不夠；固定劑對(duì)組織有一定媒染作用，固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因；淋巴結(jié)處理不當(dāng)造成切片染色后組織見(jiàn)發(fā)灰現(xiàn)象，主要原因是細(xì)胞密集，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，導(dǎo)致固定液難以滲透到組織深部。

2. 處理方法：提高烤片溫度和時(shí)間，確保脫蠟徹底；優(yōu)化脫水的梯度乙醇時(shí)間，切片經(jīng)過(guò)低濃度時(shí)時(shí)間要短，向高濃度逐漸延長(zhǎng)脫水時(shí)間；重新封片，確保蓋玻片上沒(méi)有殘留封固劑；及時(shí)固定組織標(biāo)本，確保固定液濃度合適；對(duì)于淋巴結(jié)等復(fù)雜組織，可以用等量無(wú)水乙醇乙醚混合液處理切片5-10分鐘，乙醇洗，水洗，3%硫酸鐵銨溶液補(bǔ)充媒染5分鐘。

（4）染色后切片有黑色雜質(zhì)，氣泡

1. 原因：雜質(zhì)多為蘇木素染色液中的金屬膜粘附于載玻片上；封片過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。

2. 處理方法：每天染色前仔細(xì)過(guò)濾蘇木素染液，或使用半氧化蘇木素染色液；仔細(xì)檢查封片過(guò)程，確保沒(méi)有氣泡產(chǎn)生。可以使用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，防止日后褪色。

（5）細(xì)胞核染色過(guò)淺

1. 原因：蘇木精染色時(shí)間不足，未能使細(xì)胞核充分?jǐn)z取染料；分化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞核染色過(guò)淺。

2. 處理方法：適當(dāng)延長(zhǎng)蘇木精染色時(shí)間，確保細(xì)胞核充分染色；減少分化時(shí)間，避免過(guò)度分化。

（6）細(xì)胞質(zhì)染色不佳

1. 原因：伊紅染色時(shí)間不足，未能使細(xì)胞質(zhì)充分?jǐn)z取染料；伊紅染色液中的pH值不合適。

2. 處理方法：適當(dāng)延長(zhǎng)伊紅染色時(shí)間，確保細(xì)胞質(zhì)充分染色；在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸，調(diào)節(jié)pH值，改善細(xì)胞質(zhì)染色效果。

（7）組織切片收縮、變形

1. 原因：染色過(guò)程中切片干燥：導(dǎo)致切片收縮、變形，影響神經(jīng)元形態(tài)。

2. 處理方法：在染色過(guò)程中保持切片濕潤(rùn)，避免切片干燥；切片從二甲苯取出或進(jìn)入二甲苯前，切片周邊均應(yīng)擦干凈或吸干多余水分。

（8）封片問(wèn)題

1. 原因：封片時(shí)使用的樹(shù)脂濃度不當(dāng)，可能導(dǎo)致日后褪色；蓋片選擇不當(dāng)，如漏出一部分組織塊，將會(huì)導(dǎo)致褪色。

2. 處理方法：使用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片，防止日后褪色；選擇大于組織塊面積的蓋片，確保沒(méi)有部分組織塊漏出；確保樹(shù)脂濃度適中，封片時(shí)沒(méi)有氣泡。

三、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1. 緩沖液的使用：組織切片在染色前必須在適當(dāng)?shù)木彌_液中浸泡，染色期間pH值應(yīng)始終穩(wěn)定。

2. 固定時(shí)間：如果組織塊在福爾馬林中固定時(shí)間長(zhǎng)，組織酸化而影響細(xì)胞核著色，需要在自來(lái)水中沖洗時(shí)間長(zhǎng)一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30分鐘。

3. 分色時(shí)間：切片染蘇木精后，分色這一步是關(guān)鍵，應(yīng)在顯微鏡下控制進(jìn)行，一般以細(xì)胞核染色清楚而細(xì)胞質(zhì)基本無(wú)色為佳。

4. 脫水和透明化：組織切片需要通過(guò)一系列的酒精濃度逐漸脫水，并用透明劑如苯酚、二甲苯等進(jìn)行透明化；透明化后切片會(huì)變得更加清晰，便于染色。

5. 洗滌步驟：未充分清洗會(huì)導(dǎo)致染色劑殘留，影響結(jié)果的質(zhì)量；每個(gè)處理步驟后，應(yīng)該用足夠的緩沖鹽水徹底洗滌。

6. 避免空氣暴露：空氣中的灰塵和污染物會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不利影響，因此在染色過(guò)程中，需要避免將切片長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，并保持實(shí)驗(yàn)室的清潔和衛(wèi)生。

7. 監(jiān)控染色反應(yīng)：染色的過(guò)程應(yīng)該密切監(jiān)測(cè)，以便在必要時(shí)進(jìn)行微調(diào)；需要管理好每個(gè)步驟的時(shí)間和溫度，以避免過(guò)度染色或染色不足的情況發(fā)生。

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